大鼠死后心血中大肠杆菌含量与早期死亡时间相(2) - 心血管外科杂志(电子版)杂志社投稿

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大鼠死后心血中大肠杆菌含量与早期死亡时间相(2)

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2 结果

2.1 SD大鼠尸体变化

SD大鼠处死后18 h，有轻微异味产生。死后72 h，尸体腹部出现肿胀，口腔开始有腐败液体流出，臭味明显，尸体表面可见脱毛现象，腹部有尸绿形成。死后96 h，尸体皮肤下有腐败静脉网形成。

2.2 SD大鼠心血DNA样本的浓度测定

用分光光度法分别测量不同PMI下SD大鼠心血样本DNA浓度，取1μLDNA样品，加入Nano Drop（Thermo）上，检测每组样本 DNA浓度，取平均值（表 4）。

表3 质粒标准品浓度测定样品测量1 测量2 测量3 平均数D2-1 378.1 374.1 372.0 374.7

表4 SD大鼠死后96 h内心血样本DNA浓度测定PMI/h 0 12 24 36 48 60 72 84 96总 DNA 浓度/（ng/μL） 33.5 52.6 54.8 60 65.1 105.6 108.6 111.4 135.3 SD/（ng/μL） 0.70 1.48 1.57 2.02 0.70 0.61 1.04 1.08 0.82

对上述样本的检测浓度绘成线性趋势图，检测结果显示在SD大鼠死后96 h时间段内，死后12 h DNA浓度开始增高，死后60h增速加快，至死后96h达到高峰。对SD大鼠死后96 h心血DNA浓度变化值经过EXCEL软件相关分析，得出回归方程式：y=1.0233x+31.647，PMI与DNA浓度的决定系数R2=0.9345，表明DNA浓度随着PMI的延长而呈增加趋势，两者之间存在着较强的正相关（图3）。

图3 SD大鼠死后96 h内心血样本DNA浓度变化趋势图

2.3 SD大鼠心血DNA样本qPCR

对PMI为0～48 h的5个时间点SD大鼠心血样本进行检测。根据标准曲线定量结果，几乎均无扩增，类似阴性，初步得出，PMI为0～48 h，扩增 Ct值均在35以后，说明SD大鼠心血中未有LacZ基因的存在（图4）。

图4 PMI为0～48h SD大鼠心血样本LacZ基因检测图谱

对PMI为60～96 h的4个时间点SD大鼠心血样本进行检测，同批次扩增标准品，制备标准曲线，根据标准曲线定量结果，发现各时间点的样本均有扩增产物出现（图 5～6）。

图5 标准品质粒扩增图谱

图6 PMI为60～96h SD大鼠心血样本LacZ基因检测图谱

以标准品浓度梯度稀释的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立LacZ荧光定量PCR检测的标准曲线（图7）。曲线回归得标准曲线方程为：Ct=-3.65lgX+27.04（直线斜率 A=-3.65，截距 B=27.04，X 为模板浓度，单位 pg/μL），曲线相关系数r=0.9822，说明标准曲线线性较好。根据A=-1/log（1+E）（E为荧光定量PCR反应的扩增效率），得该次荧光定量PCR扩增效率为88%，符合荧光定量PCR对扩增效率的要求。根据标准曲线，可计算出实际样本中LacZ基因的浓度，图中标“×”为实际样本扩增在标准曲线线性拟合图中的位置。

图7 标准曲线线性拟合图（标×位置为实际样本）

按照上述标准曲线，对60～96 h的4个时间点心血样本检测，每组样本基因浓度取平均值（表5）。

表5 SD大鼠死后60～96 h心血样本中LacZ基因浓度PMI/h NTC 60 72 84 96 LacZ 基因浓度/（pg/μL） 0.02 0.06 0.12 1.55 13.48 SD/（pg/μL） 0.01 0.01 0.04 0.01 2.78

对上述定量检测样本中LacZ基因的趋势图（图8）检测结果显示在SD大鼠死后60 h LacZ基因浓度开始增加，随着PMI的延长呈指数式增长，至死后96 h达到高峰。对SD大鼠死后60～96 h心血DNA样品检测LacZ基因浓度变化值经EXCEL软件相关分析，得出回归方程式：y=，PMI与DNA浓度的决定系数R2=为0.9569，表明DNA浓度随着PMI的延长而呈增加趋势，两者之间存在着较强的正相关。

图8 SD大鼠死后60～96 h心血DNA样本中LacZ基因浓度变化趋势图

3 讨论

个体死亡后，抑制微生物生长的平衡被打破，腐败菌开始大量繁殖，并在尸体腐败的进程中起主导作用。2009年刘茜[4]利用生物发光法检测大鼠死后不同时间点尸体组织中微生物ATP含量，初步证实在大鼠尸体上腐败菌存在着量的变化性规律。但是ATP检测只能反映存活状态细菌的数量，不能反应出死亡细菌的数量，而且其在死后早期易受个体本身ATP的干扰。2014年谢丹[5]通过检测尸体不同部位的腐败菌多样性的演替规律，发现利用优势菌群的演替变化可用于推断PMI，但是该研究只是对优势菌群的种属做了定性鉴别，而没有相关的定量研究，因此推断的PMI只能是大概的一个时间段，精确性不高且需检测的指标偏多。

笔者认为，在尸体腐败降解过程中，无疑存在着腐败菌数量的变化，通过检测腐败菌DNA含量更能准确反映出腐败菌的变化情况，而目前国内外学者应用qPCR技术定量检测大肠杆菌的研究主要集中在疾病诊断治疗和食品卫生安全等方面[6-8]，本研究将检测大肠杆菌DNA含量的技术应用到法医学PMI推断中来，在国内外研究中罕见报道。

文章来源：《心血管外科杂志(电子版)》网址: http://www.xxgwkzz.cn/qikandaodu/2021/0507/693.html